1. Incorporar una tecnología de propagación masiva de material escaso mediante clonación.2. Alcanzar porcentajes de éxito comerciales en la multiplicación in vitro de nogales, como planta terminada.3. Transferencia tecnológica con centros de investigación extranjeros.4. Introducir en el mercado nacional el uso de plantas de nogal autoenraizados, variedades y portainjertos.
Lograr la introducción de material a cultivo in vitro.;Establecer una metodología de multiplicación in vitro.;Establecer una metodología de enraizamiento y aclimatación de nogales producidos in vitro.;Presentar al mercado chileno un producto planta de nogal producida in vitro de vanguardi
Se concluye que el protocolo de introducción de la Universidad de Davis continúa revelando los mejores resultados a diferencia de los protocolos establecidos por profesionales propios de nuestro laboratorio. Sin embargo, los ensayos se ven empañados por el efecto negativo que causa en el prendimiento la exudación de fenoles propia del material vegetal adulto, causando una considerable pérdida de individuos. En la metodología 1 (UC Davis) se han logrado resultados de introducción del nogal cv Chandler de solamente un 10% del total introducido como promedio de los tres bloques de ensayo, mientras que en el nogal cv. Serr se alcanzó un porcentaje de éxito mayor con casi un 35% del total introducido como promedio de los tres bloques. En la metodología 2 (Viverosur) no se lograron resultados de introducción del nogal cv Chandler en el medio 13, mientras que para el medio P solo hubo un 3% de éxito como promedio de los tres bloques. En el nogal cv. Serr se alcanzó un porcentaje de éxito mayor en el medio P con alrededor del 21% del total introducido como promedio de los tres bloques. Con respecto al uso de antioxidantes en el medio de cultivo en laboratorio, se concluye que no existe un efecto significativo de su existencia, una vez que las plántulas se encuentran in vitro con un desarrollo juvenil. Los punto críticos propuestos para este proyecto son referentes a la primera etapa de introducción de material al laboratorio y establecimiento de al menos un medio de cultivo de desarrollo de yemas de nogal. Si bien el protocolo no es definitivo y solamente se ha efectuado para las dos principales variedades cultivadas en el país, existe un éxito relativo en haber logrado introducir las yemas a los medios de cultivo, tener la metodología de la Universidad de California (Davis) e importar material desde Estados Unidos libre del virus Cherry Leaf Roll. Otro punto crítico de importancia es mejorar la técnia de lavado de fenoles exudados por el material vegetal y que inhiben el prendimiento de las yemas. Inf. N° 4 Este 4to período del proyecto se enfocó principalmente en ensayar y obtener técnicas estables de enraizamiento y aclimatación de plantas de nogal in vitro, enfocándonos en el manejo de portainjertos VLACH. Para ensayar el enraizamiento se evaluaron diversas técnicas tanto in vitro como ex vitro, las cuales fueron obtenidas por asesoría internacional, este profesional luego nos visitó a fin de año 2012 en nuestro laboratorio y vivero. Los resultados de enraizamiento no pudieron ser obtenidos debido a pérdida de todo el material por necrosis y contaminación, en consecuencia estos ensayos se volverán a establecer en el 5to período del proyecto. En nuestro laboratorio in vitro evaluamos medios de cultivo con modificaciones en sus componentes, obteniendo así un protocolo mejorado que es el que se utiliza desde entonces para la propagación in vitro de nogal. A fin de este año realizamos la importación de nogales variedad VLACH, plantas que cumplieron su cuarentena in vitro correspondiente en nuestro laboratorio de Casablanca. Este material nos da pie para continuar con los ensayos de enraizamiento en el próximo período, en espera de una importación final a realizar en los próximos meses y con lo cual esperamos dar inicio al programa de propagación y venta de portainjertos de nogal tolerantes a phytophtora y a nemátodos, únicos disponibles en Chile. Inf. 5 Se depuró y mejoró aún más el medio de cultivo necesario para la propagación clonal de nogal, adaptado en esta ocasión para el portainjerto VLACH que en 3 lotes o intentos anteriores no mostraba buen desarrollo dentro de las condiciones vitro. Un cuarto lote resultó en plantas sanas y de buen vigor gracias a un aumento en la concentración de reactivos componentes. Se mejoraron las técnicas de manipulación y multiplicación in vitro del portainjerto VLACH, estableciendo un protocolo específico para esta variedad, que incluye cortes precisos para generar estaquillas de 2 cm o más, selección de las estaquillas por origen (zona apical o basal de la planta madre), plantación en el nuevo medio acorde a esta selección y además acorde al área foliar de los explantes, reducción de la emisión de fenoles al evitar estrés en los explantes por contaminación, deshidratación en cámara de flujo laminar o por agotamiento o baja disponibilidad de los reactivos en el medio de cultivo. Se incluyó dentro del protocolo de micropropagación de esta variedad una etapa intermedia de inducción y formación primaria de raíces, las que se realizan utilizando la infraestructura del laboratorio externa a las salas de crecimiento de plantas vitro, ya que el explante se debe exponer a condiciones cada vez menos artificiales y reguladas como las de un laboratorio en cuanto a asepsia ambiental, luminosidad, humedad ambiente y temperatura. Se pasarán a plantar los VLACH con raíces iniciales en 3 distintos tipos de sustrato, un solo formato de contenedor. INF. TEC. FInal Establecimiento del material En los ensayos de medios de cultivo y tipos de sellado de contenedor para establecer las introducciones de material de nogal, los resultados obtenidos no fueron los esperados, principalmente debido a las pérdidas por oxidación (o producción de fenoles) en el material ingresado a vitro; sin embargo, se obtuvo los mejores resultados en la variedad de nogal Serr, que tal y como se observa en la figura no posee altos grados de fenolización a comparación de la variedad de nogal Chandler. Para el establecimiento del material de portainjertos de nogal Vlach, las importaciones inicialmente pasaron por una brecha de pérdidas debido a contaminaciones por hongos y bacterias, para luego repuntar su crecimiento al trabajar solo con el material inicial sano. Del material importado en Septiembre 2012 (Anexo 3), se obtuvo material inicial para trabajar relativamente sano. De esta importación, se ocuparon 100 plantas para repique, de las cuales se obtuvo 207 plantas. Las 23 plantas de categoría C se descartaron. Durante octubre 2012 se realizó otra importación de 600 plantas Vlach in vitro (Anexo 4), sin embargo, de la totalidad de potes con plantas ingresados a nuestro laboratorio, considerable cantidad venía con tapas rotas y medio licuado, lo que condujo a mermas por contaminación principalmente de hongos. Finalmente, se liberaron de cuarentena 118 explantes sanos en noviembre de 2012. Además, durante Mayo de 2013 se realizó una importación adicional de 500 plantas de Vlach (Anexo 5), no obstante, tampoco generó material inicial de calidad en su totalidad, obteniéndose solo 40 plantas con poca bacteria y ninguna planta totalmente limpia para establecer el nuevo lote. Micropropagación Se ensayaron diversas concentraciones de reguladores de crecimiento, además de cambiar concentraciones o fuentes de reactivos, siempre modificando el medio de cultivo base DKW. El medio que evidenció mejores resultados en cuanto a mayor elongación del explante, grosor del eje de crecimiento y sanidad del material fue el medio DKW modificado, el cual es descrito en el Anexo 2. Adicionalmente, para obtener una técnica de propagación in vitro con buenos resultados, no solo fue necesario ensayar diversos medios de cultivo, sino además mejorar la manipulación y corte del material, además del período de tiempo de cultivo. Para definir el tiempo de cultivo óptimo (período de tiempo que transcurre entre multiplicaciones del material), durante principios del proyecto se ensayaron distintos tiempos bajo las mismas condiciones de cultivo. Finalmente, y frente a los resultados repetidos también en otras variedades, se definieron 30 días entre repique, ya que mostró la mayor tasa de multiplicación del material inicial; a períodos menores las plantas aún no se han desarrollado lo suficiente como para multiplicarlas, y a períodos mayores de tiempo el material se encuentra envejecido y comienza a deteriorarse. En cuanto a la técnica de corte, se instruyó a operarias a realizar solo cortes verticales, los que implican sacar la planta del frasco o pote, cortar la base o callo, cortar todas las hojas del eje principal (el material nuevo se debe generar a partir de la brotación de yemas axilares), y seccionar el eje en trozos menores que incluyan a lo menos 2 yemas. Luego, el material se plantó en potes conteniendo 8 explantes cada uno, cada pote con material clasificado según su origen: base, zona media o ápices de la planta, sin mezclar distintos orígenes en un mismo pote, tendiendo así a homogeneizar el futuro crecimiento de los explantes. Inducción al enraizamiento Desde diciembre 2013, en cuanto obtuvimos una partida de casi 20mil plantas de nogal Vlach in vitro, se evaluó la inducción del material para pasar después a la etapa de enraizamiento. El material seleccionado fueron plantas de 4 o más centímetros de altura, el cual se colocó en otro medio DKW modificado (Anexo _) con mayor concentración de auxinas en comparación al medio de multiplicación. Se evaluaron diversas dosis y tiempos de exposición (en oscuridad) de los explantes en este medio. Plantación y enraizamiento ex vitro De las 17.800 plantas de nogal Vlach puestas en medio de inducción, 14.500 plantas fueron cosechadas fuera de laboratorio y plantadas en nuestro invernadero especializado en enraizamiento y aclimatación, entre los días 23 y 28 de diciembre 2013. Las plantas se evaluaron en invernadero luego de 10 y 15 días de la plantación para observar enraizamiento y prendimiento. Las plantas expuestas a enraizamiento en la mezcla de sustrato 1/3 de turba + 1/3 de arena + 1/3 de acícula de pino compostada necrosaron en casi un 60% de la cantidad ensayada, a diferencia de las plantas establecidas en el sustrato general utilizado, mezcla de ½ medida de turba kekilla y ½ medida de perlita, el cual necrosó solo en un 15%. Las plantas expuestas a enraizamiento en la mezcla de sustrato 1/3 de turba + 1/3 de perlita + 1/3 de capotillo de arroz resultaron en una pérdida casi absoluta, llegando al 92% de pérdida y 8% de sobrevivencia solo con 3 plantas a los 12 días de plantación, a diferencia de sus similares pero plantadas en el sustrato general utilizado, mezcla de ½ medida de turba kekilla y ½ medida de perlita. De las sobrevivientes, solo algunas generaron raíces, siendo un resultado muy por debajo de lo programado para esta etapa en desarrollo. De la escasa cantidad de plantas enraizadas, el 80% resultó a partir de la dosis 20 mg/L de IBA y 5 días de exposición. Plantación y enraizamiento in vitro Las plantas inducidas en dosis de IBA 3, 6 ó 12 mg/L y con 5 días de exposición fueron cosechadas y establecidas en potes vitro con vermiculita + medio de cultivo estéril para que comenzaran el enraizamiento el día 21 de diciembre 2013. A una semana de haber sido establecidos estos ensayos, la totalidad de ellos mostró la misma necrosis de tejidos basales como aquellos que resultaron en el ensayo de enraizamiento ex vitro. Figura: Pote en laboratorio con medio de cultivo + vermiculita; se observan las plantas en su interior con necrosis basal o del eje principal de las plantas. Conclusiones y Recomendaciones Luego de finalizado este período, y sin obtener las plantas de nogales esperadas dentro del plazo de vigencia del proyecto, hemos de continuar de manera privada con los ensayos y evaluaciones necesarias para superar el hito crítico de esta producción, el enraizamiento de los explantes que fueron exitosamente propagados in vitro. Se augura con seguridad un futuro para la venta de los portainjertos Vlach clonales que esperamos obtener como producto final, entregando a clientes una planta de calidad y que otorgue a sus huertos uniformidad, productividad, y sobrevivencia en suelos con riesgo de anegamiento, nematodos y riesgo de patógenos del suelo como phytophtora.